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靶向小鼠KRT5基因的CRISPR/Cas9系统设计与打靶效力分析

【来源:《华夏医学》编辑部 | 作者:王蓉等 | 编辑:李佳睿 | 发布日期:2023-01-09】

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摘要:目的:单纯型大疱性表皮松解症(EBS)是一种单基因遗传性皮肤疾病,KRT5基因突变是其主要的遗传学病因。本研究在综合分析人KRT5基因的致病突变位点后,在其附近设计、合成3条sgRNA序列,并构建靶向小鼠KRT5基因的CRISPR/Cas9系统,以模拟人KRT5基因的致病突变。方法:分析数据库中人KRT5基因的致病突变位点,设计3条小鼠拟突变位点sgRNA序列;构建pGL3-U6-KRT5-sgRNA表达质粒,然后采用LipofectamineTM3000转染试剂将pGL3-U6-KRT5-sgRNA表达质粒与pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表达质粒共同转染入小鼠N2a细胞,再以嘌呤霉素和杀稻瘟菌素进行筛选;采用PCR产物测序和TA克隆测序鉴定突变序列,分析打靶效力。结果:成功构建了3个pGL3-U6-KRT5-sgRNA表达质粒,将其转入小鼠N2a细胞后,打靶KRT5基因的效力最高为64.29%,最低为16.67%。结论:设计的CRISPR/Cas9系统可以有效打靶小鼠KRT5基因,为后续建立KRT5基因编辑的小鼠模型,探讨KRT5基因在EBS发生、发展中的作用和机制奠定基础。

关键词:CRISPR/Cas9;基因编辑;单纯型大疱性表皮松解症;KRT5;

DOI:10.19296/j.cnki.1008-2409.2022-05-001

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